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Pfu DNA高保真聚合酶(P1021-P1022-P1023-P1024)

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P1021(250U) P1022*(250U) P1023(1000U) P1024(1000U)

Pfu DNA聚合酶

Cat. #P1021P1022P1023P1024

產品簡介

Pfu DNA聚合酶是極端嗜熱性細菌Pyrococcus furiosus來源的高度熱穩定DNA聚合酶,分子量為90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。擴增片段的長度可達5 kb(簡單模板)。延伸速度為2min/kb70~75℃,簡單模板可達20s/kb)。該酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,擴增產物具有平末端。

產品組成

Component

P1021

250U

P1022

250U

P1023

1,000U

P1024

1,000U

Pfu DNA聚合酶(5U/μl

50 μl

50 μl

200 μl

200 μl

10× Pfu   BufferMg2+ Plus[1]

1.25 ml

1.25 ml

1.25 ml × 2

1.25 ml × 2

6× Loading Buffer[2]

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

dNTPs2.5mM[3]

-

1 ml

-

1 ml × 2

[1] 10× Pfu Buffer分為Mg2+ PlusMg2+ Free兩種包裝,可方便選擇。如無特別說明提供10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus)Mg2+ Free10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl2

[2] 6× Loading Buffer,如有需要可單獨購買(Cat. #M9041)。

[3] dNTPsdATPdGTPdCTPdTTP等摩爾混合物,P1021/P1023不含dNTPs,如有需要請單獨購買(Cat. #P9011/P9012/P9013)。

活性定義

一個活性單位(U)指用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物,在72℃30 min內,攝入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存條件

-20℃保存2年。

質量控制

純度檢測:經質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測:PCR方法檢測無宿主殘余DNA,能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。

應用舉例

1. 配制反應體系

請于冰上配置反應體系,體系大小與組分用量與添加順序可調整:

Ordinal

Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)

1

10× Pfu   BufferMg2+ Plus

5 μl

2

dNTPs2.5mM

4 μl

0.4 mM

3

upstream primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4 μM

4

downstream primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4 μM

5

Pfu DNA聚合酶(5U/μl[2]

0.5 μl-1 μl

2.5U-5U

6

template DNA[3]

1-4 μl

<1μg

7

超純水[4]

To 50 μl

-

optional

MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5]

Variable

-

[1] 引物終濃度建議范圍:0.1-1 μM。特異性差時可降低濃度,效率低時可提高濃度

[2] 根據目的片段擴增的難易程度調整DNA聚合酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建議用量如下表(50 μl反應體系)。

Template

Dosage

人類基因組DNA

0.1μg-1μg

λDNA

0.5ng-5ng

大腸桿菌基因組DNA

10ng-100ng

質粒DNA

0.1ng-10ng

[4] 可單獨訂購超純水(Cat. #P9021/P9022/P9023)。

[5] 可單獨訂購25mM MgCl2Cat. #P9031)和PCR EnhancerCat. #P9041)。

2. 設定反應程序進行PCR反應

Stage

Temperature

Time

Number of Cycles

Initial Denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

30 sec

25-35

Annealing

55-68℃[1]

30 sec

Extension

72℃

Variable[2]

Final Extension

72℃

5-10 min

1

[1] 退火溫度應根據Tm值較低的引物來設。

[2] 延伸時間按2min/kb來設最佳(簡單模板可達20s/kb)。

3. 分析結果

將產物與loading buffer混勻后進行瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。如有需要,可進行割膠回收。

無產物或產物量少的改進措施有:1調整退火溫度;2減少抑制劑的影響,如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分,需要高倍稀釋(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脫,提高模板DNA的純度;4使用PCR添加劑,如PCR EnhancerCat. #P9041MgCl2Cat. #P9031等可提高產量。

操作注意事項

1 室溫下Pfu DNA聚合酶有一定的活性,為避免發生非特異性擴增,請于冰上配置反應體系,并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA

2 Pfu DNA聚合酶的擴增產物只有平末端,可直接用于平末端連接。如要進行TA克隆,請先進行加A反應,以提高克隆效率。(加A反應:參考如下體系,72℃15-30min

PCR(純化)產物

1-7 μl

10× Taq BufferMg2+ Plus

1 μl

dATP

0.2 mM

Taq DNA聚合酶

5U

超純水

To 10 μl

堿基出錯率是指在每個堿基合成過程中所摻入的錯誤核苷酸數目。Pfu DNA聚合酶的堿基錯誤率為1×10-6

4 dUTPdITP和含有這些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR擴增。因為該酶與含有尿嘧啶和次黃嘌呤的DNA模板結合后會中止DNA聚合反應。

引物設計注意事項

引物長度一般在15-30個堿基之間;上下游引物3’末端避免互補,避免出現3個以上重復的GC,或出現發夾結構,否則會產生非特異性擴增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量盡量接近;Tm值控制在55-65℃之間,且上下游引物Tm值盡量接近,額外附加序列(酶切位點、修飾等)是非模板匹配序列,不參與Tm值計算。

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名稱

貨號

規格

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